IPHASE/汇智和源 原代肝细胞—药物研发“CP”重点问题解答

原代肝细胞—药物研发“CP"

—重点问题解答—

第一题    贴壁和悬浮肝细胞使用的优缺点是什么？在具体实验过程中应该如何选择呢？

答：肝细胞被分离后，可进行悬浮培养或贴壁培养。悬浮培养的原代肝细胞在最开始的4~6h内细胞色素P450酶的活性最为和体内一致，随时间的延长而迅速下降，故悬浮肝细胞一般用于代谢稳定性研究或代谢物谱研究。贴壁培养的原代肝细胞有足够的时间从损伤中恢复过来，保持了正常肝细胞的生物学特征及代谢活性，一般用于酶诱导研究、药物细胞毒性研究、慢代谢药物的代谢稳定性或产物推断研究。

第二题    贴壁原代肝细胞复苏之后可以存活多久，如果肝细胞复苏后不做贴壁培养可以维持多久？

答：

（1）贴壁原代肝细胞一般用于酶诱导实验，细胞复苏后使用铺板培养基悬浮，调整细胞至适宜浓度后使用胶原包被板进行培养，一般在4~6小时内细胞可进行贴壁。细胞贴壁后，更换维持培养基继续维持18h，以保证细胞状态能最大可能恢复。接下来，即可开展酶诱导实验，并进行代谢活性和mRNA诱导水平的检测。从整个周期来看，肝细胞贴壁后可以维持6~7天状态，且随时间延长细胞贴壁状态变差，细胞会出现脱落悬浮现象。

（2）如果贴壁肝细胞不进行贴壁培养，我们验证过在4~6小时内是可以维持在较好的状态，更长时间的验证我们还暂时未开展。

第三题    关于贴壁肝细胞，会进行哪些酶的诱导实验？诱导效果如何？

答：我们的原代肝细胞均会使用指导原则推荐的阳性诱导剂对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4三种酶的诱导效果进行评估，且酶诱导结果符合要求才会进行销售。《药物相互作用指导原则》明确规定研究在研药物是否为代谢酶的诱导剂应评估其是否会诱导主要的 CYP 同工酶 CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 或 CYP3A4。研究初期， 可只评估 CYP1A2，CYP2B6 和 CYP3A4。

第四题    酶诱导实验为什么选择三个供体肝细胞？

答：根据《药物相互作用指导原则》介绍，至少采用三个供体，每个供体的诱导结果应单独评估。如果至少一个供体的结果超过了预定的阈值，则在研药物可能具有诱导作用，需进行后续评估。

第五题    酶诱导实验中，若其中一个供体有1A2的诱导作用，其他两个供体没有，需要重复验证，需要怎么验证？

答：如需进行重复验证，可以通过增加供体数、重复实验等多种方法对实验结果进行确证。评估在研药物对代谢酶潜在诱导作用的方法主要有以下三种：倍数变化方法、相关性方法、基础动力学模型等，具体可参考《药物相互作用指导原则》。

第六题    为什么只关注 CYP酶的诱导，而不关注二相酶如UGT的诱导？

答：只关注CYP酶的诱导是因为对CYP酶的诱导机制已经研究的较为清楚，而没有要求对UGT酶的诱导进行研究是由于目前对其机制还不是很清楚，并不是说它不会被诱导。指导原则中也有说到，对于转运体以及 II 相代谢酶的诱导剂或者抑制剂还没有标准化的分类系统。

第七题    3个供体是不是相当于做重复实验，为了数据统计有意义？

答：选择三个供体进行实验，除了使结果具有统计学意义外，更重要的也是为了评估个体间的差异，如果至少一个供体的结果超过了预定的阈值，则在研药物可能具有诱导作用，需进行后续评估。

第八题    酶诱导实验中进行细胞活性测定选什么方法合适？中性红法会不会影响到后续的反转录过程？

答：为保证酶活性检测不会影响到后续的反转录过程，通常在检测方法和试剂的选择上需要非常谨慎，通常大家都会选择CCK-8或cell-Titer进行细胞活性检测。目前，也有关于使用中性红染料对肝细胞进行活率检测的报导，具体可参照下文。

第九题    酶诱导实验使用的原代肝细胞需使用哪些试剂和耗材？

答：酶诱导实验需要用到胶原包被板和四种配套的培养基，分别为：复苏培养基，用于细胞复苏过程；贴壁培养基，用于肝细胞初始贴壁；维持培养基，用于细胞状态的恢复和后续诱导；孵育培养基，用于诱导后酶活性的测定。

第十题    酶诱导实验的过程是什么？可使用同一块板吗？

答：体外肝细胞诱导实验基本流程：

①使用复苏培养基进行细胞复苏；

②使用铺板培养基基将细胞进行悬浮调整细胞密度后进行细胞铺板（胶原包被板）；

③铺板4-6小时后细胞贴壁，更换维持培养基进行换液维持18小时。

④维持后细胞恢复最好状态开始诱导实验，一般周期为2~3天。

⑤诱导结束后使用孵育培养进行药物代谢测定。另外，测定药物诱导活性、活力测定、mRNA表达水平等测定使用同一块板。需要注意的是，肝细胞贴壁培养要使用推荐的培养基，如使用维持培养基进行细胞贴壁，维持培养基内营养成分不足以维持细胞贴壁所需营养，则达不到预期实验结果。

十一题    悬浮原代肝细胞可以培养多久？有没有测试过其它Buffer的维持效果，如HBSS？

答：悬浮原代肝细胞复苏后，我们会使用自研的孵育培养基进行细胞维持，一般情况细胞可悬浮维持4-6小时，且随着时间延长细胞会逐渐死亡。目前，我们还未测试过其它Buffer对细胞的维持效果，如HBSS。

十二题    药物体外研究中最常使用的系统是肝微粒体，肝微粒体也包含了药物代谢相关的主要CYP酶、UGT酶等，那么为什么还要选择肝细胞呢？

答：微粒体在常规药物代谢研究中应用广泛，如代谢途径研究，酶抑制研究等，但是与原代肝细胞相比，微粒体却有其自身劣势：

（1）微粒体内所含酶直接暴露，药物或其代谢产物与代谢酶之间有现成的反应通路，而不能反映体内的情况，而且微粒体需要辅助因子参与才可进行药物代谢反应；

（2）肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌ling氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等；

（3）微粒体中富含细胞色素P450酶和UGT酶，因此与其他酶之间不存在竞争性，这会导致药物在微粒体中比在完整的细胞体系内表现出更高的生物转化率。然而，原代肝细胞却体现出了其优势，例如药物扩散、转运、代谢的过程是基于整体细胞水平的，而且原代肝细胞培养后可维持数天的活性，这提高了评价药物代谢酶上调或下调的可行性等。

十三题    在肝细胞代谢稳定性实验中阳性化合物质控的标准是多少呢？

答：目前，还没有明确的文件规定阳性化合物半衰期和清除率的接受范围，并且每个公司选择的阳性化合物也可能不同，大家可分析自己公司的历史数据，形成自己内部的接受标准。本公司原代肝细胞产品也会选择大家使用频率最高的阳性化合物，对其半衰期和清除率进行测定，并将其展现在我们的产品COA中，供大家挑选。

十四题    本公司能否提供除猴、犬、大鼠、小鼠等常见种属之外的其它种属肝细胞定制服务？

答：除常规种属的原代肝细胞外，本公司还可提供特定种属、特定周龄等的定制服务，具体可联系商务团队，我们也会根据您的实验需求推荐最适肝细胞选择。

十五题    是不是因为使用的培养基的不同，肝细胞既能当作悬浮细胞使用，又能当成贴壁细胞使用呢？

答：大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁，但不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁。细胞贴壁与否首先会与细胞本身状态有关；同时贴壁细胞也需要特定培养基及一些特殊的促细胞附着物质（如鼠尾胶原、如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程）等。也就是说，贴壁细胞我们可以作为悬浮细胞使用，但悬浮细胞不一定可用于贴壁使用。

十六题    代谢稳定性研究中微粒体和肝细胞该如何选择？是不是只需要选择其中一个就可满足要求？

答：在代谢稳定性研究中，选肝微粒体还是选肝细胞，主要还是要看化合物的代谢特性，谁代谢速率高选谁。一般情况下，优先选用肝微粒体，尤其是在化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为第一选择。当有证据显示二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用肝细胞进行实验。通常情况下，选择一个代谢系统即可满足需求，若各方面条件允许，两个系统同时选择肯定是很好的。

十七题    有机溶剂的加入对肝细胞有什么影响？

答：孵育体系中有机溶剂的含量要控制在1%以内。孵育体系中发挥代谢作用的组分是酶，而酶的本质是蛋白，有机溶剂加入过多，会导致酶变性，活性降低或丧失，故孵育体系中要控制有机溶剂的加入量。

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