细胞的冻融要经历什么流程

　　冷冻保护剂添加了冷冻保护剂的冻存液，一般都是高渗透压的。当细胞从生理溶液转移到低温保存溶液时，由于胞外溶液中的渗透压较高，细胞会脱水，同时低温保存溶液的小分子扩散到细胞内时，细胞体积会缓慢减少；如果冷冻保存液中只有非穿透性冷冻保护剂(如葡聚糖和蔗糖)，细胞也会脱水并保持脱水状态，只是冷冻保护剂不能进入细胞内。在解冻复苏阶段，水从细胞外的低渗溶液迅速移动到细胞内的高渗透溶液，而小分子冷冻保护剂则向相反的方向缓慢移动，导致细胞体积膨胀，并达到细胞内外的渗透压恢复平衡。所以，在细胞冷冻处理和解冻复苏的过程中，稍有差错，细胞就会因为渗透压的过度变化，导致细胞膜破裂而死亡。这就是细胞的渗透压力性损伤。

　　细胞冻存和复苏采取“慢冻快融”的原则，慢速冷冻可使细胞内的水份渗出细胞外，减少细胞内形成冰晶的机会，快融以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水份渗入细胞内，再次形成胞内冰晶造成对细胞的损伤。

　　(一)细胞冻存

　　配制含10%DMSO或甘油的细胞冻存液，4℃预冷(新鲜配制的冻存液会产生大量的热)；

　　取对数生长期的细胞，用细胞消化酶将单层生长的细胞消化下来；悬浮细胞则直接将细胞收集到离心管中；

　　离心1200rpm，6 min；

　　去除上清液，逐渐加入适量预冷的细胞冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中的细胞终浓度为5×10e6/ml~1×10e7/ml；

　　将细胞分装入冻存管中，每管1~1.5ml；

　　在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作人员姓名；

　　冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；到达-80℃时，则可迅速放入液氮中。

　　(二)细胞复苏

　　佩戴眼镜和手套，从液氮中取出冻存的细胞管。

　　迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其*融化，然后在无菌条件下取出细胞。

　　1200rpm/min离心5-10min，弃去上清，加入适量培养液混匀后接种于培养瓶中，次日更换一次培养液。

　　解冻后洗涤是去除冷冻保护剂最常见的方法，即对细胞进行洗涤液或培养液重悬后离心，去除上清液，然后将细胞重新悬浮在洗涤液或培养液中。然而，需要注意的是，解冻后洗涤会造成冻存细胞的数量损失。