体外染色体畸变试验方法及注意事项

体外染色体畸变试验方法及注意事项

体外染色体畸变试验的目的是检测培养的哺乳动物细胞染色体结构畸变。结构畸变可份为染色体型和染色单体型。大多数化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突都也可发生。多倍体增加表明受试物可导致染色体数目畸变。但是，本方法不用于检测数目畸变。染色体突变和相关事件可以引起很多人类遗传性疾病，并且有证据表明，引起体胡魔癌基因和抑癌基因改变的染色体突变以及相关事件，与人类和实验动物的肿瘤发生有关。体外柴色体畸变试验可应用于已建立的细胞系、细胞株或原代细胞培养，根据培养生长能力、核型的稳定性、染色体数目、染色体差异以及染色体响变的自发频率选择合适的细胞。

北京汇智泰康医药技术有限公司针对染色体畸变试验开发染色体畸变试验试剂盒， 本试剂盒省去了阳性底物成分准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合染色体畸变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

染色体畸变试验导则

1  规范性引用文件

OECD. OECD Guidelines for Testing of Chemicals. 473 In vitro Mammalian Test, 1-10. Paris: OECD, Adopted2lst July, 1997.

2  定义

2.1  染色单体型畸变(chromatid-type aberration )

显示为单个染色单体断裂或染色体单体间断裂或断裂和重接的染色体结构损伤。

2.2  染色体型畸变（chromosome-type aberration）

显示为两个染色单体在同一部位断裂或染色体单体间断裂或断裂和重接的染色体结构损伤。

2.3  内复制 （endore-duplication）

在DNA复制的S期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体有4、8、16…倍的染色单体。

2.4  裂隙（gap）

染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的小错误排列。

2.5  有丝分裂指数（mitotic index）

    处于有丝分裂M期的细胞数占其总细胞数的百分数。细胞增殖程度的指标。

2.6  数目畸变(numerical aberration)

    染色体数目改变，不同于所用动物或细胞染色体的正常数目。

3  原理

体外染色体畸变试验的目的是检测培养的哺乳动物细胞染色体结构畸变。结构畸变可份为染色体型和染色单体型。大多数化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突都也可发生。多倍体增加表明受试物可导致染色体数目畸变。但是，本方法不用于检测数目畸变。染色体突变和相关事件可以引起很多人类遗传性疾病，并且有证据表明，引起体胡魔癌基因和抑癌基因改变的染色体突变以及相关事件，与人类和实验动物的肿瘤发生有关。体外柴色体畸变试验可应用于已建立的细胞系、细胞株或原代细胞培养，根据培养生长能力、核型的稳定性、染色体数目、染色体差异以及染色体响变的自发频率选择合适的细胞。

4  仪器和设备

   培养箱、恒温水浴、二氧化碳培养箱、压力蒸汽消毒器、、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、离心机、无菌细胞培养瓶，玻璃器皿等。

5  操作方法和程序

5.1  准备

5.1.1  细胞

可利用包括人体细胞在内的多种细胞系、细胞株或原代细胞培养，如中国仓鼠成纤维细胞、人或其他哺乳动物的外周血淋巴细胞。

5.1.2  培养基和培养条件

应使用适当的培养基和培养条件(培养皿，CO2浓度，温度和湿度)维持培养。已确立的细胞系或细胞株应常规核实染色体众数和检测支原体污染，如有污染则不应使用。应了解正常的细胞周期时间和培养条件。

5.1.3  培养物准备

已建立的细胞系和细胞株:从贮备的培养物中增殖细胞，接种的密度应使细胞在收获时未达到融合，细胞培养于37C。

淋巴细胞:从健康的个体采得经抗凝剂( 如肝素)处理的全血或分离的淋巴细胞，加至含促细胞分裂剂(植物凝集素等)的培养基中，并于37"C培养。

5.1.4  代谢活化

在有或无适当的代谢话化系统条件下，将细胞暴露于受试物。常用的代谢话化系统是以酶诱导剂如Aroclorl254或苯巴比安和β-茶黄酮联合处理啮齿类动物肝脏制备的去线粒体后组分(S9) 及辅因子系统。S9在培养液中终浓度范围为1%~10% (体积分数)。代谢活化系统的条件可能取决于受试物的类别。在某些情况下，需要使用不同浓度的S9。通过遗传工程建立的可表达特殊活化酶的细胞系，将使内源性活化成为可能。细胞系的选择要提供科学的依据(如通过细胞色素P450同工酶与受试物代谢的相关性进行判断)。

5.2  试验条件

5.2.1  溶剂/赋形剂

所用溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应，并且应对细胞存活率和s9活性无影响。如果采用不常用的溶剂/赋形剂，应有资料表明其对细胞存活率和S9活性无影响。推荐采用水作溶剂赋形剂，当受试物在水中不稳定时，则所用的有机溶剂应该是无水的。可使用分子筛去除水。

5.2.2  染毒浓度

在决定高浓度时应考虑受试物的细胞毒性、在试验系统中的溶解性以及pH或渗透压的改变。

正式试验中应该在有和无代谢活化条件下，利用能反映细胞完整性和细胞生长情况的指标来检测细胞毒性和溶解性，如融合程度、活细胞计数或有丝分裂指数等。预试验有助于确定细胞毒性和溶解性。

至少应设置3个剂量组，在有细胞毒性时，浓度范围应包括大细胞毒性至几乎无细胞毒性。组间距为(2~)倍。在收获时，高浓度组的细胞融合程度、细胞计数或有丝分裂指数均应该有显著降低(大于50%)。有丝分裂指数只是间接测定细胞毒性/细胞生长抑制作用的方法，而且依赖于细胞处理后的时间，但是，对于悬浮细胞培养物，其他的毒性测试方法可能比较繁琐且不实用，有丝分裂指数就比较适用。细胞周期动力学资料如平均传代时间(average generation time, AGT)可用于作为确定染毒浓度的补充资料。对于相对无细胞毒性的化学物，高浓度应该是5 uL/ml, 5 mg/ml或0.01 mol/L,取低的一种。

无细胞毒性且相对不溶的受试物，所用的高剂量应保证在染毒期末的终培养液中有可见沉淀。在有些情况下(例如仅在略高于低溶解浓度时才出现细胞毒性)，可在多于一个肉眼可见沉淀的浓度进行试验。应在染毒开始和结束时评价溶解性，因为在试验系统中存在细胞、S9和血清等，溶解性可能在染毒过程中发生改变。不溶性之后肉眼可见的沉淀。沉淀不应不干扰计数结果。

5.2.3  对照

每个试验应包括在有和无代谢活化条件下同时进行的阳性和阴性(溶剂/赋形剂)对照。在利用代谢活化时，阳性对照应是需要代谢活化才显示致突变作用的化学物。

阳性对照物(已知的断裂剂)在暴露水平应有超过本底值的可重复和测量的增加，以证实试验系统的敏感性。但阳性对照物的浓度不应使读片者立即发现其为阳性对照标标本片。阳性对照物如表1所示。

表1  体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

也可利用其他适当的用性对服物。如有可能，应利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。

在每个收获时间都应包括相应的阴性对照。阴性对照在处理培养液中含溶剂/赋形剂，并以同样的方法处理培养物。而且，也应该有未染毒对照，除非本底对照资料证明，所选用的溶剂无细胞毒性或致突变作用。

5.3  操作方法

5.3.1  受试物处理

在有和无代谢活化系统条件下，以受试物染毒处于增殖期的细胞。淋巴细胞应在有丝分裂刺激后的48 h开始染毒。

一般对每个浓度和阴性/溶剂对照应该用双份平行培养物。当本底资料可以证明双份平行培养物之间变异较小时，对每个浓度改用1个培养物也可以接受。

气态或挥发性物质应以适当的方法试验，如用密闭的培养瓶。

5.3.2  收获时间

在一次试验，细胞应在有和无代活化条件下染毒3~6h,并在染毒开始后约1.5倍的正常细胞周期时采样。如此方案在有或无代谢活化时均为阴性结果，应再进行一次无代谢活化的试验，适当延长染毒时间。某些化学物在染毒/采样时间长于1.5 倍正常细胞周期时更易检测。在有代谢活化条件下得到阴性结果，需要根据情况予以证实。如认为阴性结果不必进行证实，应提供适当理由。

5.3.3  染色体制备

在收获前以秋水仙素或秋水仙胺处理细胞培养物1~3h。各个细胞培养物分别收获和低渗、固定和染色，以制备染色体。

5.3.4  染色体分析

包括阳性和阴性对照的所有涂片，应在显微镜分析之前独立编号。由于固定过程通常会导致处于分裂中期细胞的同源染色体丢失，因此所计数细胞的着丝粒数应等于细胞染色体众数+2。每个浓度组和对照组至少计数200个分散良好的中期相细胞(如果可行，2个平行培养样分别计数100个细胞)。当观察的畸变数很高，计数的中期相数可以减少。

虽然此试验的目的是检测染色体结构畸变，但应同时观察和记录多倍体和内复制。

6  大鼠肝微粒体酶的诱导和S₉的制备

6.1  诱导

泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。本巴比钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。

1.  S₉制备

动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化家溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化加溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化家溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S₉）分装于塑料管中。每管装2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。

上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S₉所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S₉制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。大鼠肝微粒体肝S9制备过程时间较久，也可以直接联系北京汇智泰康购买现有肝微粒体，肝S9，NADPH再生系统，UGT孵育系统等产品。

高7  数据和报告

7.1  数据处理

试验单位是细胞，应评价有染色体结构畸变细胞百分率。对染毒组和对照组应列出染色体结构畸变的类型及其数目和频率。应分别记录裂除并报告，但一般不包括在总畸变率中。

应记录同时进行的所有染毒组和阴性对照组细胞毒性结果。

应提供各个培养物的资料，并且以表格形式总结所有的资料。

对明确的阳性结果不要求证实。对可疑的结果应进一步试验， 改变试验条件。应对阴性结果进行证实，方法如5.3.2 所述。在进一步试验中应考虑改变试验参数，包括改变浓度间距和代谢活化条件。

7.2  结果、评价和解释

判断阳性结果的标准为染色体畸变细胞数有浓度相关性增加和/或在一个或多个浓度有可重复的增加。应首先考虑结果的生物学意义。利用统计学方法分析，以有助于评价试验结果。但是，统计学显著性不应是确定阳性反应的-因素。

多倍体的细胞数增加可表明受试物能抑制有丝分裂过程和导致染色体数目畸变，内复制的细胞数增加可表明受试物抑制细胞周期进展。

结果不符合上述标准的受试物，可认为在本系统为阴性结果。

虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，但在极少情况下，所得到的资料不能对受试物的致突变性进行明确的判断。经多次重复试验，结果仍然是可疑的。

体外染色体略变试验的阳性结果表明受试物能对培养的哺乳动物体细胞诱导染色体畸变。阴性结果表明在试验条件下受试物对培养的哺乳动物体细胞不能诱发染色体畸变。晴变。

1. 试验的解释和评价

8.1  体外试验一般需要外源性代谢活化系统的支持。此代谢活化系统不可能*模拟哺乳动物体内条件。应注意避免假阳性结果的发生，这些假阳性结果可能由于pH、培养基渗透压的改变或高度细胞毒性所致。

8.2  本试验用于筛选可能的哺乳动物致突变物和致癌物。本试验结果为阳性的很多化学物是哺乳动物致癌物；但本试验和致癌性之间并无很好的相关性。相关性取决于化学物类别，已有证据表明此试验未检出的致癌物并不是通过直接损伤DNA的机制起作用的。

体外染色体畸变试验试剂盒优势
便捷—— 本试剂盒省去了诱导 S9 制备，阳性底物、秋水仙素的配制和浓度条件摸索的时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合体外哺乳动物细胞染色体畸变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。
试剂盒使用操作流程
1. 实验器材、试剂准备：1640RPMI培养基、牛血清、青链霉素双抗、胰蛋白酶消化液、75，25cm²细胞培养瓶、,50mL 或 15mL 试管、200μl 和1000μl 枪头、0.22μm 滤膜、注射器、平皿、二甲基亚砜、灭菌 蒸馏水等；
2. 设置待测物剂量，配制各剂量无菌待测物溶液；
3. 将处于对数生长期，贴壁生长良好的CHL细胞用0.25 %胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5 mL/瓶接种于25cm²细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中加湿培养约24 h-48h；
4. 吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、0.05mL S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液补足至5mL，于培养箱中处理6h，换成含有10%牛血清的*培养基。在收获细胞前4 h加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素溶液（终浓度为0.2 mg/mL）；
5. 用0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞，加入0.075mol/L氯化加溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，记录畸变细胞的坐标位置及畸变类型，具体操作方法参照国标方法进行；
6. 阅片。

试验设计及受试物的特殊处理
1) 剂量设计 决定受试物高剂量的原则是受试物对试验细胞的毒性和受试物的溶解度。对于纯的化学物质，一般高剂量为 5 mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细胞产生小毒性浓度。对于毒性很低、摄入量很大的定型产品，可根据其溶解度和对细菌的毒性采用可能的大剂量，至少3个剂量组，每个剂量应做2个平皿。
2) 溶剂 溶剂可选用水、二甲基亚砜或其他溶剂（溶剂剂量应限定在毒性剂量以下。以二甲基亚砜为例，一般不超过1%）， 无论选用什么溶剂均应无诱变性。
3) 对照组的设置 试验应同时设有阳性物对照组、溶剂对照组和未处理对照，均包括加S9和不加S9两种情况。
4) 受试物的特殊处理 若遇特殊受试物作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：
a)  食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成分，可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。
b)  挥发性受试物：可采用真空干燥器处理等方法。
c)  天然植物材料：可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。

常见问题及原因分析
1、收获细胞较少：贴壁细胞生长到70-80%左右时开始染毒，人或哺乳动物外周血淋巴细胞；
2、自发回变数显著高于标准 原因：a. 培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量高；b.培养皿经环氧乙烷消毒不*或环氧乙烷有残留；
3、阳性底物诱变菌落数偏离标准范围 原因：a. 阳性底物溶解不*或未充分混匀；b. 阳性底物添加量不准确；c. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9失活；d. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；
4、待测物诱变菌落数非常低或没有菌落 原因：a. 待测物或待测物溶剂对细菌生长有毒性；b. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9 失活； c. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；
5、菌落分布不均匀，集中偏向一侧。原因： 倒底层或顶层培养基时平皿未水平放置；
6、顶层或底层培养基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 顶层或底层培养基中琼脂粉含量低；b. 顶层培养基中加入的溶剂或待测物酸化，导致凝胶不充分；
7、如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性 将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。如果经受试 物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处 理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,则说明经受试物处理 的菌株没有发生突变，试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。